豆豉纤溶酶的纯化及其它性质研究
阎家麒 童 岩1 臧莹安1
（河南绿十字生物工程研究所，郑州4500081；郑州牧业工程高等专科学校，郑州450008）
摘 要：由发酵大豆（豆豉）分离纯化一种活性强的纤溶酶，采用硫酸铵盐析，Sephadex G-100和Sephacryl S -200色谱纯化的纤溶酶，在SDS
- PAGE上呈现一条蛋白带，M r31000，等电点8.6 + 0.2。纯化倍数44倍，纯酶比活31020 UK/mg，活性回收率68%。由于该酶具有较强的催化纤维蛋白原溶解的作用，因而有望成为一种新型抗血栓药物或预防血栓病的保健食品。
关 键 词 纤溶酶；纯化；豆豉；纳豆激酶
中图分类号：R977.3 文献标识码：A
豆豉是我国人民的传统发酵大豆食品，并具有开胃增食，消积化滞，驱风散寒以及预防心脑血管疾病等功效。我们从豆豉中分离纯化一种具有较高纤溶活性的溶栓酶并初步研究其酶学性质。
1.材料与方法
1.1菌株
依据中国豆豉生产方法 [1] 制作豆豉62批，从中筛选出5株苦草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），经发酵实验，从中筛选出1株在发酵产物中产生高纤溶活性蛋白酶的菌株，作为本研究的出发菌株。
1.2 材料与试剂
大豆，产地辽宁。选用新鲜、颗粒饱满的小型豆。尿激酶标准品：中国药品生物制品检定所提供，700 IU/支；人工合成底物：Suc-Ala-Ala-ProPhe-p-nitroanilide，sigma产品；H-D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilide
(S-2251)，H-D-Val-Leu-Arg-p-nitroanilide (S-2266)，Pyro-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide
(S-2444) 和H-D-Phe-Pip-Arg-p-nitroanilide (S-2238) 均为瑞典Kabi Vitrum公司产品；Sephadex
G-100，Sephacryl S-200为Pharmacia产品；低相对分子质量标准蛋白，上海东风生化试剂厂产品；纳豆激酶，32000 UK/mg pro.日本ヤマダフース公司产品；纤维蛋白原，凝血酶，纤溶酶原，Boehringer
Mannheim产品。其余试剂均为国产分析纯。
1.3 方法
1.3.1纤溶活性测定
1.3.1.1纤维蛋白原-琼脂平板的制作 依据Astrup纤维蛋白平板法[2]略加改进。称取2g琼脂糖置于250 ml烧瓶中，加入0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5)180
ml，沸水浴中加热30 min，冷却至55-60℃，加入事先配好的纤维蛋白原溶液20ml(含100-150mg)，迅速混匀，事先在每个培养皿中加入200
μl凝血酶（50 U/ml）和200μl纤溶酶原，然后再在每个培养皿中加入20ml纤维蛋白原-琼脂糖溶液，迅速混匀后，静置10min，凝固后即为半透明的平板。用3mm套管打孔，每个平板打孔4-6个。
1.3.1.2标准曲线的制作 在平板上选定6个孔，每孔内加入0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5)10μl。将稀释好的标准品尿激酶(5 IU/ml)依次加入6个孔中，体积分别为2μl，4μl，6μl，8μl，10μl，12μl，混匀后，置37℃恒温箱中，保温18h。用卡尺测量每个溶圈的直径，以溶圈面积为纵坐标，以标准品尿激酶每毫升活性单位为横坐标作图。
1.3.1.3 样品的测定 在平板上选定3个孔，每个孔加入0.01mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液10μl，然后将稀释好的样品编号，依次加入孔内2μl，6μl，10μl。置37℃恒温箱中保温18h。用卡尺量取溶圈的直径，计算溶圈面积，由标准曲线计算其活力。3点取平均值，样品活力以“尿激酶活力单位”（UK）表示。为了减少系统误差，将样品与标准品置于同一平板上进行测定。
1.3.2 酰胺水解活性测定 按文献[3]方法进行。将人工合成底物分别溶于0.05mol/L Tris-HCL(pH7.5)，含NaCl 0.1mol/L的缓冲液，使底物浓度为0.5mmol/L。待测酶水溶液10μl与底物溶液1ml混合，于25℃反应1min，在波长405nm处连续检测被释放的对硝基苯胺，1ml反应液内1min水解1nmol底物的酶量定义为1个酶活力单位。
1.3.3 溶解纤维蛋白的作用方式 将纤维蛋白原-琼脂平板于85℃加热30min制成加热平板，测定豆豉纤溶酶和纳豆激酶在加热平板上的纤溶活力，以此判断两种酶溶解纤维蛋白原的作用方式。
1.3.4 蛋白质定量方法 依据Bradford氏法[4]，以牛血清白蛋白为标准。
1.3.5 Mr 测定 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，参照Laemmli方法[5]进行。胶浓度12.5%，交联度5.6%。
1.3.6 等电点的测定 盘状等电聚焦电泳法[6] 测定酶的等电点。
1.3.7 豆豉纤溶酶的急性毒性试验 按文献[7]方法进行。选用昆明小鼠20只，体重20+2g雌雄各半，ig，给药，每日1次，每次1ml。药物含量为：0.05g/ml，0.1g/ml，0.2g/ml，0.3g/ml，0.4g/ml，0.5g/ml，0.6g/ml，0.7g/ml，0.8g/ml，连续观察14天。
1.4 豆豉纤溶酶的制备
1.4.1 摇瓶种子培养
1.4.1.1 培养基(%) 麦芽糖2.0，果糖2.0，大豆胨1.5，酵母浸膏0.2，KH2PO4 0.1，K2HPO4 0.3， MgSO4·5H2O
0.05，CaCl2·2H2O 0.02，去离子水加至100%，Ph7.0。
1.4.1.2 方法 在500ml三角烧杯中，分装100ml培养基，高压灭菌(121℃，20-30min)。以2%接种量接种菌孢子悬液(1×103个/ml)混匀，置旋转式摇床(振幅25mm，转速270r/min)，30℃震荡培养18h，在波长660nm，光径1cm测OD值。
1.4.2 发酵培养
1.4.2.1 培养基(%) 麦芽糖2.0，果糖2.0，大豆浆30.0，酵母浸膏0.2， KH2PO4 0.1，K2HPO4 0.3，MgSO4·5H2O
0.05，CaCl2·2H2O 0.02，去离子水加至100%，Ph7.0。
1.4.2.2 方法 在8L LF-G5A型自控发酵罐中加入5L培养基，自动定温灭菌。在无菌条件下将种子培养液100ml接种罐种(2%)，同时加入经高压灭菌的消泡剂（甘油聚醚）0.1%。发酵温度自动控制在30+0.2℃，Ph值7.0，搅拌转速800r/min。空气无油三级过滤，通气量5L/min，发酵时间76h。放罐后，发酵液经5000r/min离心20min。取上清液，先加入硫酸铵使饱和度至25%，离心除去杂蛋白，再加入硫酸铵使饱和度至60%，搅拌溶解后冷处静置过夜。然后弃上清液，离心收集沉淀，超滤除盐，得豆豉纤溶酶粗品。
1.5 酶的纯化
1.5.1 Sephadex G-100 柱层析分离豆豉纤溶酶 将已溶胀2d的Sephadex G-100装入层析柱(1.0cm×25cm)，用0.1mol/L
PBS 0.2mol/L NaCl(pH7.4)缓冲液平衡。然后将粗酶液5ml小心加入柱中，以相同缓冲液脱洗，以每5ml为一管分部收集，用Astrup纤维平板法检测洗脱液，收集含有纤溶活性的组分。
1.5.2 Sephacryl S-200柱层析纯化豆豉纤溶酶 Sephacryl S-200装入1.5cm×9.2cm柱中，用0.1mol/L PBS，0.5mol/L
NaCl，pH7.4缓冲液平衡，上样后以相同缓冲液洗脱，分管收集呈单一对称峰的活性组分，蒸馏水透析过夜，冷冻干燥，得白色粉末豆豉纤溶酶。
2 结果
2.1 豆豉纤溶酶纯化
豆豉纤溶酶纯化结果见表1
从5L发酵液中得到的豆豉纤酶总活力为 1.55×106 尿激酶单位(UK)。经Sephadex G-100和Sephacryl S-200 色谱纯化后的样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检查为单一蛋白条带，表明得到了豆豉纤溶酶的纯酶，纯化倍数为44倍，活性回收率为68%。
2.2 酰胺水解酶活性 采用5种合成的小分子肽作为反应底物。表2显示，豆豉纤溶酶最敏感的底物是枯草杆菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的底物，其次是血浆纤溶酶底物(S-2251)，对其余酶底物活性较低。
阎家麒等:豆豉纤溶酶的纯化及其性质研究
Tab 1 Purification of fibrinolytic enzyme
Purification Total Total Specific Yield Purification
Step protein activity activity (%) (-fold)
(mg) (UK) (UK/mg)
Medium 5010.0 1.55×106 705 100 1
Sephadex G-100 63.3 1.25×10 6 19740 81 28
Sephacryl S-200 32.2 1.00×106 31020 68 44
Tab 2 Comparative amidolytic activity of fibrinolytic enzyme with several synthetic substrates
Substrate Original protease Substrate hydrolysis
nmol/min·ml
Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-Pna Subtilisin and chymotrypsin 91.7
H-D-Val-Leu-Lys-pNA(S-2251) Plasmin 66.9
H-D-Phe-Pip-Arg-pNA(S-2238) Thrombin 14.5
H-D-Val-Leu-Arg-pNA(S-2266) Kallikrein 14.1
Pyro-Glu-Gly-Arg-pNA(S-2444) Urokinase 0
实验结果表明，豆豉纤溶酶有其特异的蛋白水解作用和识别位点。
2.3 酶的Mr SDS-PAGE测得豆豉纤溶酶Mr 31000，为一种单链多肽酶
2.4 酶的等电点 在IEF-PAGE中，先用pH3.5~10Ampholine粗测，然后用pH8~9.5Ampholine测定，将电泳后的凝胶条带精确切割，浸出两性电解质，测得豆豉纤溶酶等电点为8.6+0.2。
2.5 酶的稳定性
2.5.1 酶的热稳定性 将酶溶于0.2mol/L硼酸缓冲液(pH7.0)，再不同温度和不同时间，于37℃下测定酶活性，以未经保温的酶液为100%，实验结果表明，豆豉纤溶酶在40℃以下稳定性良好，50℃1小时严重失活，60℃活性全部丧失。
另将酶溶液于-18℃冻结，然后融化至室温，如此反复5次冻融。测定酶活性均保存95%以上，说明冻融对该酶活性无大影响。
2.5.2 酶得酸碱稳定性 将已对无离子水透析的酶液稀释于0.02mol/L的不同pH的硼酸缓冲液，于室温(18℃)分别放置2h和16h，取出立即置入冰浴，用0.2mol/L硼酸缓冲液调Ph至7.0，测酶活性。结果表明，该酶在pH7~11范围内稳定，而在pH值低于5时，很快失活。
2.6 豆豉纤溶酶的急性毒性 豆豉纤溶酶各剂量组给小鼠灌胃后，任何剂量水平均无明显毒性表现。直至****剂量80g/kg仍测不出LD50，则MTD＞80g/kg。按化学物质的急性毒性分级标准(WHO，1977)，豆豉纤溶酶属于实际无毒。
2.7 溶解纤维蛋白原的作用方式及与纳豆激酶的区别 纳豆激酶(Nattokinase)是日本学者须见洋行于1987年发现的来源于纳豆的溶栓酶[8]。我们用相同酶量考察豆豉纤溶酶和纳豆激酶在普通平板和加热平板上的纤溶能力，发现在普通平板上两者无显著差异，说明两者均可激活纤溶酶原，使其转化成纤溶酶，进而溶解纤维蛋白原。但在经加热85℃，30分钟使纤溶酶原灭活了的平板上，豆豉纤溶酶仍显示于普通平板相同的溶圈，而纳豆激酶的溶圈面积均小于前者的1/3。由此可以推断，豆豉纤溶酶则是直接溶解纤维蛋白原。它们是否为同一种酶，尚需比较两者的氨基酸序列才能确定。此外，豆豉纤溶酶Mr为31000，须见洋行报导的纳豆激酶Mr
，开始用SDS-PAGE测定为35000[9]。用凝胶过滤测定为20000。后来Fujitaq等人用SDA-PAGE精确测定其Mr为27728，并用氨基酸序列测定结果相印证[10]。因此，豆豉纤溶酶与纳豆激酶在Mr上存在差异。出现这些差异的原因，可能与菌种不同有关。日本纳豆激酶的菌株主要来源于自然发酵的纳豆(Bacillus
natto)和来源于稻草的野生菌株，我们采用的菌株来源于中国传统食品豆豉。有人用三明治酶联免疫吸附法测定14种商品纳豆激酶，发现虽然同属枯草芽孢杆菌，但不同菌种来源的纳豆激酶中的纤溶成分仍有所不同[11]。
3 结 语
豆豉纤溶酶是一种高效的可直接溶解纤维蛋白的纤溶酶，不仅纤溶能力强，而且安全。豆豉纤溶酶是从传统食品中发现的新型纤溶酶，无论作为抗血栓药物或是预防血栓病的保健食品，都具有十分重要的开发价值。
参 考 文 献
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2 Astrup T，Mullertz S. The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity
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3 Wohl RC，Summaria L，Robbins KC.Kinetics of Activation of Human Plasminogen
by Different Activator Species at pH7.4 and 37℃ [J] . J Biol Chem，1980，265：2005
4 Bradford MM. A rapid and sensitive metbod for the hydrophobic chromatography，qraphy.
ion-exchange chromatography and gel chromatography. quantiation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding [J]. Anao
Biochem，1976，26：248
5 Laemmli UK. Cleavase of structural proteins during the assembly of the head
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6 Brewer JM. Electrophoresis. in Experimental techniques in biochemistry [R].
eds by Brewer JM. Prentice-Hall Inc，Englewood Cliffs，New Jersey.1974.128
7 袁伯俊，王治乔. 新临床前安全性评价与实践[M] . 北京：军事医药科学出版社，1997.23
8 Sumi H， Hamada H，Tsushima H，et al. A novel fibrinolytic enzyme（nattokinase）in
the vegetable cheese Natto；a typical and popular soybean food in the Japanese
diet [J]. Experientia，1987，43：1110
9 须见洋行.纳豆キナーセよ纤溶系[J]. 化学よ生物，1991，20：119
10 Fujita M，Nomura K，Hong K，et al. Purification and characterization of a strong
fibrinolytic enzyme（nattokinase）in the vegetable natto，a popula soybean fermented
food in Japan [J]. Biochem Biophys Res Commun，1993，197（3）：1340
11 Yuki Y，Nakagama T，Fujita M. A sandwich enzymelinked immunosorbent assay for
natto [J]. Biotech Biochem，1994，58（2）：366